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Arbeitsgebiete: Ionenkanäle und Photorezeptoren - Mechanismen von Licht-aktivierten Enzymen und Ionen-Transportern, sowie biotechnologische Anwendungen.
Laufende Forschung: Der menschliche Anionenkanal CFTR; Struktur und Mechanismus der Transport-Rhodopsine; Struktur und Mechanismus der Licht-aktivierten Adenylatcyclase PAC.
Regulation von CFTR
Mukoviszidose (Cystic Fibrosis) ist die häufigste Erbkrankheit mit erheblich verkürzter Lebenserwartung in Westeuropa. Die Krankheit ist rezessiv, d.h. sie tritt erst auf, wenn Gene auf beiden Chromosomen (von Mutter und Vater, also homozygot) mutiert sind. In Deutschland sind ca. 5% der Bevölkerung gesunde (heterozygote) Merkmalsträger. Sie können, meist ohne es zu wissen, die Krankheit weitervererben. Bei Menschen mit dieser Erkrankung ist der Wassergehalt der Körpersekrete zu niedrig. In Epithelien werden daher zähflüssige Sekrete gebildet, wodurch es in den betroffenen Organen (vor allem in Lunge und Pankreas) zu erheblichen Funktionsstörungen kommt.
Das mutierte Gen wurde 1989 kloniert und, da die Funktion zunächst unbekannt war, CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) genannt. Mittlerweile ist gut belegt, dass CFTR ein Anionenkanal ist, der durch Proteinphosphorylierung sowie durch zytoplasmatisches ATP/ADP reguliert wird. Wir exprimierten CFTR in Oozyten von Xenopus laevis und zeigten eine zusätzliche Regulation durch Lipide mit Signalfunktion, nämlich Phosphatidylinositolphosphate (PIP), insbesondere PIP2 (Himmel & Nagel, 2004). Außerdem zeigten wir, dass CFTR kein Regulator des epithelialen Natriumkanals (ENaC) ist und worin die Ursache für anderslautende (falsche) Schlussfolgerungen liegt (Nagel et al., 2001; Nagel et al., 2005).
Da CFTR durch die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) aktiviert wird, kann es die zytoplasmatische cAMP-Konzentration anzeigen, weswegen wir CFTR auch zur Charakterisierung von PAC (siehe unten) benutzen.
Die Transport-Rhodopsine (Mikrobielle oder Typ I Rhodopsine)
Rhodopsine sind Membranproteine mit sieben Transmembranhelices (7TM) die den Licht-absorbierenden Chromophor Retinal kovalent gebunden haben. Während die tierischen Rhodopsine G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR) darstellen, die über eine Signalkette Ionenkanäle steuern, findet man bei Mikroben (Bakterien, Archaea und eukaryotischen Einzellern) Rhodopsine, die selbst Ionen – aktiv oder passiv – über die Membran transportieren. Zu den aktiven Transportern zählen die Ionenpumpen Bakteriorhodopsin (eine Protonenpumpe) und Halorhodopsin (eine Anionenpumpe), während die kürzlich entdeckten Channelrhodopsine direkt durch Licht gesteuerte Ionenkanäle sind. Wir untersuchen die elektrischen Eigenschaften von Halorhodopsin und Channelrhodopsinen, die wir in Oozyten von Xenopus laevis exprimieren. Durch Mutagenese von Aminosäuren versuchen wir, Erkenntnisse über deren Funktion zu gewinnen und Transport-Rhodopsine mit veränderten Eigenschaften herzustellen.
Die Transport-Rhodopsine eignen sich hervorragend zur nicht-invasiven, Licht-gesteuerten Modulation des Membranpotentials. Kürzlich zeigten wir zusammen mit kooperierenden Neurobiologen, dass Halorhodopsin zur Gelblicht-induzierten Hyperpolarisation von Nervenzellen und zur Licht-gesteuerten Unterdrückung von Aktionspotentialen genutzt werden kann (Zhang et al., 2007). Bereits 2003, wie wir die elektrischen Eigenschaften von Channelrhodopsin-2 erstmals beschrieben, zeigten wir dessen großes Potenzial, Zellen durch Blaulicht zu depolarisieren (Nagel et al., 2003).
Die Channelrhodopsine wurden in einer Kooperation mit Peter Hegemann (Humboldt Universität zu Berlin), der sie in der einzelligen Grünalge Chlamydomonas reinhardtii identifizierte, erstmals von uns charakterisiert. Sie stellen eine neuartige Ionenkanal-Familie dar. Wir untersuchen diese Rhodopsine weiterhin, in Kooperationen mit Ernst Bamberg (MPI Biophysik, Frankfurt/M.) und Peter Hegemann (Humboldt Univ., Berlin).
Die Licht-aktivierte Adenylatcyclase PAC
Zu den wichtigsten Signalmolekülen in lebenden Zellen gehört cAMP, das grundlegende Prozesse steuert. Bereits Einzeller weisen Signalketten auf, womit sie auf veränderte Umweltbedingungen reagieren. Viele bewegliche Bakterien und Mikroben sind zum Beispiel befähigt, mittels positiver Phototaxis photosynthetisch nutzbares Licht aktiv aufzusuchen und schädliches, intensives Licht (vor allem UV) durch negative Phototaxis oder phobische Reaktionen zu meiden. Beim grünen einzelligen Flagellaten, dem Geißeltierchen Euglena gracilis, war hierzu sowohl der Photorezeptor wie auch die Signalkette lange Zeit völlig unbekannt. Im Jahr 2002 wurde von einer japanischen Gruppe erstmals ein Proteinkomplex aus dem Paraflagellarkörper von Euglena gracilis beschrieben, der aus Flavoproteinen mit Photoaktivierter AdenylatCyclaseaktivität (PAC) bestand (Iseki et al., 2002): das Enzym erhöht Blaulicht-abhängig die cAMP-Konzentration an der Flagellenbasis.
Wir haben Bestandteile dieses Komplexes erstmals in tierische Zellen gebracht und gezeigt, dass dort Blaulicht-abhängig cAMP gebildet wird. Dazu wurde die mRNA für eine der beiden Untereinheiten des Proteinkomplexes (PACa/PACb) in Eizellen (Oocyten) des südafrikanischen Krallenfrosches Xenopus laevis eingebracht. Werden diese Eizellen mit Blaulicht belichtet, so kommt es zu einem Anstieg in der cAMP-Konzentration. Diesen cAMP-Anstieg konnten wir sowohl über cAMP-Antikörper, als auch in intakten Oozyten über cAMP-regulierte Ionenkanäle (z.B. CFTR, siehe oben) nachweisen und zeigen, dass PACa allein eine hocheffiziente Adenylatcyclase ist, während PACb eine ca. 100fach geringere Aktivität aufweist (Schröder-Lang et al., 2007).
Iseki, M. et al. A blue-light-activated adenylyl cyclase mediates photoavoidance in Euglena gracilis. Nature 415, 1047-51 (2002).
Kooperationen:
Arbeitsgruppen des SFB 567 in Würzburg
E. Bamberg, MPI für Biophysik, Frankfurt a. M.
E. Buchner/A. Fiala, Biozentrum, Univ. Würzburg
K. Deisseroth, Stanford University, Palo Alto, CA, USA
A. Gottschalk, JWG-Universität, Frankfurt a. M.
R. Grygorczyk, Univ. Montreal, Canada
P. Hegemann, Humboldt Universität zu Berlin
J.R. Riordan, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ, USA
