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    Lehrstuhl für Botanik I - Pflanzenphysiologie und Biophysik

    Regulationsmechanismen der Stomabewegung

    Die zu erwartenden Änderungen des Weltklimas werden auch in unseren Breiten vermehrt zu extremen Schwankungen führen. Um die damit einhergehenden starken physiologischen Extreme zu überleben, müssen Pflanzen ihr Wassermanagement anpassen und optimieren. Eine wichtige Rolle spielt hierbei der Gasaustausch über die Stomata, für deren Öffnungszustand der Innendruck (Turgor) der Schließzellen verantwortlich ist. Die Justierung der Stoma-Öffnungsweite wird dabei von verschiedenen internen und externen Faktoren beeinflusst, die über ein multisensorisches Netzwerk detektiert und in die jeweils benötigte Bewegung umgesetzt werden. Bisher sind zwar einige direkte Wege der Signalweiterleitung nahezu aufgeklärt, wie und wo hier aber Überlappungen und gegenseitige Beeinflussung stattfinden, wie sie beispielsweise bei verschiedenen gleichzeitig wirkenden oder aber direkt nacheinander auftretenden Stressfaktoren auftreten, ist weitgehend unbekannt. Wir haben uns daher dem Aufbau einer Transkriptomanalyse der Arabidopsis Schließzelle gewidmet. Dabei haben wir zunächst unsere Methode, intakte Schließzellen stark anzureichern, optimiert, ohne dabei zusätzlichen Stress auf das System auszuüben, wie es bei der gängigen Isolierung von Schließzellen über Protoplastierung der Fall ist. Dafür werden Blätter ohne Mittelrippe in einem Mixer zerkleinert, wobei nahezu alle Zellen mit Ausnahme der Schließzellen zerstört werden (Abbildung 1). Die so gewonnenen Präparate können dann für Analysen der Expression (Microarrays und qPCR), der Metabolite sowie der Proteine von Schließzellen eingesetzt werden. Wir haben eine Reihe von Microarrayexperimenten durchgeführt, um Gene zu identifizieren, die in Schließzellen gegenüber dem ganzen Blatt angereichert sind und durch verschiedene Stimuli reguliert werden, die zum Stomaschluss führen (Abbildung 2). Dabei konnten wir u.a. zeigen, dass Schließzellen Trockenstress direkt an niedriger Luftfeuchte erkennen und als Antwort selbst den Stomaschluss herbeiführen können (Abbildung 3). Wie diese Luftfeuchteänderung aber sensorisch erfasst und über ein chemisches Signal in die Stomabewegung umgesetzt wird, ist noch unklar und Gegenstand unserer gegenwärtigen Forschung. Dabei benutzen wir einen bioinformatischen Ansatz, um über die verschiedenen Microarrays Hinweise auf die Vernetzungsstellen der einzelnen Signalwege zu bekommen. Mit Hilfe von Markergenen, und physiologischen Experimenten an entsprechenden Arabidopsis Mutanten wollen wir so Schritt für Schritt das gesamte Netzwerk der Stomaschluss-Signaltransduktion entschlüsseln.

    Unsere Methoden:

    Physiologie

    Wir benutzen physiologische Methoden, um nach verschiedenen Reizen den Öffnungszustand der Stomata und damit den optimalen Zeitpunkt für die Probennahme zu bestimmen (Abbildungen 4 und 5).

    1. Messung der Stomabewegung über Transpiration (Gaswechsel, IRGA)
    2. Messung der Stomabewegung über den Blatturgor (nichtinvasive Druckmessonde)
    3. Präparation von intakten Schließzellen

    Molekularbiologie/Expressionsanalyse:

    1. Alle molekularbiologischen Standardmethoden
    2. Isolierung kleinster RNA-Mengen
    3. Quantitative real-time-PCR (qPCR)
    4. Microarrayanalysen
    5. RNA Sequenzierungsanalysen
    Rasterelektronenmikroskop-Aufnahmen (REM) von offenen und geschlossenen Arabidopsis thaliana Stomata
    Von links nach rechts: Arabidopsis im Rosettenstadium, Blattstücke nach Entfernung der Mittelrippen, Haushaltsmixer, Epidermisfragment mit vital-gefärbten Schließzellen.
    Abbildung 1: Schließzell-Anreicherung. Blätter von voll entwickelte Arabidopsis im Rosettenstadium werden abgeschnitten und die Mittelrippen entfernt. In einem Haushaltsmixer werden die Blattstücke mit Eiswasser gemixt, bis Epidermisfragmente übrig bleiben, bei denen nur noch die Schließzellen intakt sind (Lebendfärbung mit Neutralrot). (Grafik P. Ache, 2017)
    Experimenteller Ansatz. Links: Signale die zum Stomaschluss führen, Mitte: Stoma offen und  Pfeil zu Stoma geschlossen, Rechts: Parameter, die erfasst werden.
    Abbildung 2: Experimeteller Ansatz. Die Stomata werden mit verschiedenen Signalen (links) zum Stomaschluss gebracht, der mit verschiedenen Methode verfolgt wird (rechts, oberer Teil). Danach werden Schließzellen isoliert und mit weiteren Methoden analysiert (rechts, unterer Teil). (Grafik: P. Ache, 2017)
    Links: Stomaschluss durch ABA im Wildtyp bei trockener Luft, Blatt überlebt. Mitte: Stomata schließen nicht in ABA-freier Mutante, Blatt welkt. Rechts: Stomaschluss in Mutantenpflanze mit nur in der Schließzelle wiederhergestellter ABA-Produktion, Blatt überlebt.
    Abbildung 3: Schließzell-produziertes ABA ist notwendig und ausreichend für den durch niedrige Luftfeuchte induzierten Stomaschluss. Abgeschnittene Wildtyp (Col 0) Blätter schließen bei niedriger Luftfeuchte unter Einwirkung des Stresshormons ABA ihre Stomata und überleben. Dabei kann ABA sowohl in den Schließzellen, als auch in anderen Geweben gebildet werden. Mitte: Die Muntante (aba-3-1), die nirgendwo ABA synthetisieren kann, welkt. Unten: Wird in dieser Pflanze nur in der Schließzelle wieder ABA produziert, verhält sie sich wieder wie der Wildtyp. (Grafik: P. Ache, 2017)
    Messmethoden: Links: Gasaustauschküvette zur Messung des Wasserverlustes über die Stomata. Mitte: Drucksonde am Blatt zur Messung des Blattturgors. Rechts: Simultane Messung von Gasaustausch und Blattturgor.
    Abbildung 4: Unsere Messmethoden. Zur Bestimmung der stomatären Öffnungsweite messen wir hauptsächlich den Gasaustausch über die Stomata, wobei Luft durch eine Küvette mit Blattmaterial geleitet wird und CO2-Gehalt und Luftfeuchte differentiell vor und nach der Küvette erfasst werden. Alternativ können wir mit Drucksonden den Blattinnendruck (Turgor) messen, der steigt, weil weniger Wasser abgegeben als aufgenommen wird, wenn die Stomata sich schließen und sinkt, wenn die Stomata öffnen. Beide Methoden können auch simultan durchgeführt werden. (Grafik: P. Ache, 2017)
    Kontakt
    Universität Würzburg
    Lehrstuhl für Molekulare Pflanzenphysiologie und Biophysik - Botanik I
    Julius-von-Sachs-Platz 2
    97082 Würzburg

    Tel. +49 931 31-86101
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